显微镜方法支持纳米级的 3D、多靶点细胞成像

休斯顿，2024 年 12 月 10 日 — 一种新的显微镜平台可以通过在纳米尺度上提供多种细胞结构的快速、精确的 3D 成像，同时允许灵活控制细胞外环境，从而改进对驱动细胞行为机制的研究。

这种显微镜方法称为 soTILT3D，是具有 3D 点扩散函数 （PSF） 的单物镜倾斜光片的缩写。它由莱斯大学的一个团队开发，旨在解决现有荧光显微镜和单分子超分辨率显微镜技术的限制。

“我们对 soTILT3D 的目标是创建一种灵活的成像工具，克服传统超分辨率显微镜的局限性，”领导这项研究的 Anna-Karin Gustavsson 教授说。“我们希望这些进步将加强生物学、生物物理学和生物医学的研究，在这些研究中，纳米尺度的复杂相互作用是理解细胞健康和发病机制的关键。”

soTILT3D 显微镜平台提供可操纵、抖动、单物镜倾斜光片，用于光学切片以减少荧光背景，以及用于 3D 纳米打印微流控系统的管道，用于将光片反射到样品中。这些功能与 PSF 工程相结合，用于在 3D 中对单个分子进行纳米级定位，以及用于分析重叠发射器的深度学习，用于漂移校正和长期成像的主动 3D 稳定，以及用于无色差偏移的连续多目标成像的 Exchange-PAINT。

通过集成倾斜的光片、纳米打印的微流体系统和计算工具，soTILT3D 平台提高了成像精度和速度，从而可以在纳米尺度上更清晰地可视化细胞结构。

该系统使用单物镜倾斜光片选择性地照亮样品的薄片。通过减少来自焦外区域的背景荧光，soTILT3D 增强了对比度，使样品的图像更加清晰。此功能在研究哺乳动物细胞等厚生物样品时特别有用。

Gustavsson 说：“光片是使用与显微镜中用于成像的相同物镜形成的，它是完全可控的，抖动以去除光片显微镜中常见的阴影伪影，并且倾斜使成像一直到盖玻片。“这使我们能够以更高的精度从上到下对整个样品进行成像。”

带有嵌入式、可定制微镜的定制设计微流控系统可提供对细胞外环境的精确控制，并允许快速、受控的溶液交换。快速溶液交换功能可用于实时测试药物治疗如何影响细胞。

具有 3D 点扩散函数 （soTILT3D） 显微镜平台的单目标倾斜光片原型。由 Jeff Fitlow/莱斯大学提供。

“微流体芯片和带有微镜的纳米打印嵌件的设计和几何形状可以轻松适应各种样品和长度尺度，为不同的实验设置提供多功能性，”研究人员 Nahima Saliba 说。

微流体设备支持自动 Exchange-PAINT 成像，允许按顺序可视化不同的目标，在纳米级进行深入成像时，不会出现多色方法中常见的颜色偏移。单目标倾斜光片和微流体芯片制造方案提供了在厚哺乳动物细胞中执行高密度 3D Exchange-PAINT 成像所需的背景减少和溶液交换。

该系统使用深度学习来分析更高的荧光团浓度并提高成像速度。它使用算法进行实时漂移校正，以实现长时间稳定、高精度的成像。

Saliba 说：“该平台的 PSF 工程支持单个分子的 3D 成像，而深度学习可以处理传统算法难以处理的密集发射器条件，从而显著提高采集速度。

与传统的落射照明方法相比，soTILT3D 平台中的倾斜光片将细胞成像的信噪比提高了六倍。结果是提高了对比度和精确的纳米级定位。

“这种细节水平揭示了 3D 细胞结构的复杂方面，这些方面传统上很难用传统方法观察到，”研究人员 Gabriella Gagliano 说。

与传统方法相比，soTILT3D 显微镜平台与高发射器密度和深度学习分析相结合时，速度提高了 10 倍。这使研究人员能够在正常时间的一小部分内捕获整个细胞的复杂结构（如核层、线粒体和细胞膜蛋白）的详细图像。

该平台支持全细胞、3D、多靶标成像。它可以获取整个细胞内多种蛋白质的分布，并测量它们之间的纳米级距离，使研究人员能够精确和准确地可视化紧密排列的蛋白质的空间排列。

整个哺乳动物细胞的单分子、超分辨率成像通常受到高荧光背景和缓慢采集速度的阻碍，尤其是当多个靶标以 3D 成像时。soTILT3D 显微镜平台解决了这些限制。它提供了一种简单、灵活的 3D 超分辨率成像和单粒子跟踪方法，可以适应并用于各种单分子成像应用，以提高细胞结构和分子动力学纳米级研究的速度、效率和精度。

由 soTILT3D 显微镜系统创建的样本图像。由 Gustavsson Lab/Rice University 提供。